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博文
DNA测序技术的发展史之——第二代测序技术(1) [编辑] [删除]
2016-11-30 11:55:55 | 分类: 生物技术

        经过几十年的改进,第一代测序仪不仅在读长上有较大的突破,准确率高达99.999%,而且测定成本也大幅下降,达到每千碱基序列为0.5美元。但是,不管怎么改进,由于对电泳分离技术的依赖,第一代测序技术在速度和成本方面都已达到极限。在这种情况下,第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。

    第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定,且一般读长较短。
    目前,第二代测序技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和
Applied Biosystems SOLID system。

Roche/454 FLX:
        2005年,454 Life sciences公司(现被Roche公司收购)首先推出了基于焦磷酸测序法的超高
通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System,开创了第二代测序技术的先河。2007年,又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。
         焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术,可快速、准确的测定一段较短的DNA序列。


原理如下:
一个片段= 一个磁珠= 一条读长(one fragment = one bead = one read)


(1)样品输入并片段化
      

           大的样品如基因组DNA或者细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)等被打断成300~800 bp的片段;对于小分子的RNA或者PCR扩增产物,可直接跳到步骤3。

(2)文库制备:
      借助一系列分子生物学技术,将A和B接头(3’和5’端具有特异性)连接到DNA片段上,接头用于后续的纯化、扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。


(3)一个DNA片段=一个磁珠:
     

       单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化,形成油包水的混合物,这样就形成了只含有一个磁珠和一个独特片段的微反应器。


(4)乳液PCR扩增:


        每个独特的片段在自己的微反应器中进行独立的扩增,而没有其他的竞争性或者污染性序列的应先。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言,扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后,乳液混合物被打破,扩增的片段仍然结合在磁珠上,既可被回收纯化,又可用于后续的测序实验。


(5)一个磁珠 = 一个读长:

       携带DNA的磁珠放入PTP板(每孔容纳一个磁珠)中进行后续的测序。J将PTP板放置在GS FLX中,测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次进入一个碱基。


        如果发生碱基配对反应,则释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在酶的作用下,最终将荧光素氧化成氧化萤光素,同时释放出光信号。该信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。一个碱基配对就会有一分子的光信号,由此可以准确、快速的确定待测模板的碱基序列。


(6)数据分析:
        GS FLX系统提供两种不同恶生物信息学工具对测序数据进行分析,适用于不同的应用:达到400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。

       Roche/454 FLX 的准确率在99%以上,读长可高达400 nt。但也存在限制,主要是来自同聚物的连续掺入,如AAA或GGG,由于没有终止元件阻止单个碱基的连续掺入,同聚物的长度就需要从信号强度中推断,这个过程就会出现一定误差。

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